Characterization of the DNA repair spore photoproduct lyase enzyme from Clostridium acetobutylicum: A radical-SAM enzyme

Spore photoproduct lyase (SPL) is a “Radical-SAM” repair enzyme which catalyzes the cleavage of spore photoproduct (SP, 5-thyminyl-5,6-dihydrothymine), a specific lesion found in bacterial spore DNA, to thymine monomers by a free-radical mechanism. The enzyme requires S-adenosyl-l-methionine (SAM) and a [4Fe–4S] cluster for activity. SPL from Bacillus subtilis has been difficult to isolate and characterize due to problems with the solubility and stability of the overexpressed protein in Escherichia coli and the lability of the [Fe–S] cluster, even if the protein was purified under strictly anaerobic conditions. In order to overcome these problems we searched for another SPL enzyme and we found that the recombinant SPL enzyme from Clostridium acetobutylicum, isolated either aerobically or anaerobically from overexpressing E. coli, behaves more stably than the B. subtilis one. We report here a complete spectroscopic and biochemical characterization of this enzyme. In particular we show for the first time that, using HYSCORE spectroscopy, SAM binds to the cluster as observed in the case of other members of the “Radical-SAM” enzyme family such as the activases of pyruvate formate lyase and ribonucleotide reductase.

RésuméLa spore photoproduct lyase est une enzyme de réparation de l'ADN appartenant à la famille des enzymes « SAM-Radical ». Elle catalyse la réversion du photoproduit des spores (SP, 5-thyminyl-5,6-dihydrothymine) – une lésion spécifique de l'ADN des spores de bactéries – en deux monomères de thymines via un mécanisme radicalaire. La S-Adénosyl-l-méthionine (SAM) ainsi qu'un cluster [4Fe–4S] sont nécessaires à l'activité de l'enzyme. La SPL de Bacillus subtilis a été difficile à isoler et à caractériser, à cause de problèmes de solubilité, de stabilité de la protéine surexprimée dans E. coli, ainsi que de labilité du cluster, même si la protéine est purifiée dans des conditions d'anaérobiose stricte. Afin de surmonter ces problèmes, nous nous sommes intéressés à la SPL recombinante de Clostridium acetobutylicum, isolée, soit en aérobiose, soit en anaérobiose à partir d'une surexpression dans E. coli. Nous décrivons ici une caractérisation spectroscopique et biochimique complète de cette enzyme. En particulier, nous montrons pour la première fois, grâce à la spectroscopie HYSCORE, que la SAM se lie au cluster, de la même façon que pour d'autres membres de la famille des « SAM-Radical », comme les activases de la pyruvate formate lyase et de la ribonucléotide réductase.