Détection par cytométrie en flux des sous-populations lymphocytaires T sécrétrices d'IL-2 et IFN-γ : optimisation de la technique et établissement des valeurs de référence

RésuméUne dysrégulation de l'équilibre Th1 et Th2 a été décrite dans différentes situations pathologiques. Dans ce travail nous avons analysé la production de deux cytokines de type Th1, l'IL-2 et l'IFNγ, au niveau des différentes sous-populations lymphocytaires T circulantes chez 20 sujets sains et établi les valeurs de référence par la technique de cytométrie en flux. Nous avons fixé les conditions opératoires optimales suivantes : les cellules mononucléées sont stimulées pendant six heures par l'association PMA (20 ng/ml) et ionomycine (1 μM) en présence de bréfeldine A (10 μg/ml). Les cellules sont fixées par le paraformaldéhyde à 4 % et subissent un double marquage, membranaire (anti-CD3 ou CD4 ou CD8), puis intracytoplasmique (après perméabilisation par une solution de saponine à 0,5 %) à l'aide des anticorps anticytokines. La détermination de la fréquence des cellules productrices d'IL-2 ou d'IFNγ a montré des intervalles de confiance à 95 % assez larges : (CD3+–IL-2+ : 10,67–46,28 % ; CD4+–IL-2+ : 14,63–57,76 % ; CD8+–IL-2+ : 1,47–23,45 % ; CD3+–IFNγ+ : 2,87–21,08 % ; CD4+–IFNγ+ : 2,83–21,14 % ; CD8+–IFNγ+ : 4,60–35,28 %). Ce sont les lymphocytes CD4+ qui produisent la grande majorité de l'IL-2 (85 vs 13 % pour les CD8+). Pour l'IFNγ la situation est plus équilibrée, les lymphocytes CD4+ restent cependant les cellules majoritairement productrices (63 vs 41 %). La connaissance du profil de cytokine dans une pathologie donnée permet de mieux cerner les mécanismes effecteurs impliqués dans cette maladie et pourrait contribuer éventuellement, au choix d'une immuno-intervention.

A dysregulation in Th1/Th2 balance has been described for different pathological situations. Knowing the cytokine profile in a given pathology could assist in understanding the disease mechanism and in choosing an immune intervention most effective for the management of this condition. In this work, the production of two Th1 cytokines, IL-2 and IFN- γ, was analyzed for different T-cell subsets from 20 normal subjects (mean age 33.5 years) and reference values were defined using the flow cytometric analyses. The optimum operating conditions were set as following: mononuclear cells were stimulated with PMA (20 ng/ml) and ionomycin (1 uM) for 6 h in the presence of brefeldin A (10 ug/ml). Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then dually stained, with anti-CD3 or anti-CD4 or anti-CD8 for the membrane and with anticytokine antibody for the intracytoplasma after being permeabilized with 0.5% saponine solution. The frequency determination of cells that produce IL-2 or IFN-γ revealed large 95% confidence intervals: (CD3–IL-2: 4.60–10.67%, CD8–IL-2: 1.47–23%, CD3–IFN-γ: 2,97–32,49%, CD4–IFN-γ: 2.83–21%, CD8–IFN-γ: 4.60–35.28%). CD4+ lymphocytes produce the majority of IL-2 (85 vs 13% for CD8+). For IFN-γ, the situation is more balanced, but the CD4+ lymphocytes remain the predominant producer cells (63 vs. 41%).