Emergence of quinolone-resistant, topoisomerase-mutant Brucella after treatment with fluoroquinolones in a macrophage experimental infection model

Aim of the studyTo determine the activity of fluoroquinolones (FQ) and the selection of FQ-resistant mutants in a macrophage experimental infection model (MEIM).Material and methodsCanine macrophages were inoculated with Brucella melitensis ATCC 23457 (WT), achieving intracellular counts of around 105 CFU/mL. Cell cultures were incubated in the presence of ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LEV), moxifloxacin (MOX), and doxycycline (DOX). After cell lysis, surviving microorganisms were plated for count purposes, and plated onto antibiotics-containing media for mutant selection. Topoisomerases mutations were detected by PCR and sequencing.ResultsBacterial counts after cell lysis were 14.3% (CIP), 65.3% (LEV), and 75% (MOX) lower compared to the control. Quinolone-resistant mutants emerged in cell cultures containing CIP and LEV with a frequency of around 0.5 × 10−3. All mutants showed an Ala87Val change in GyrA. Mutants had FQs MICs around 10 × WT. The ability of these mutants for infecting new macrophages and the intracellular lysis after antibiotic exposure did not change significantly. No 2nd step FQ-resistant mutants were selected from 1st step mutants.ConclusionsIntracellular activity of FQs is low against WT and gyrA-mutant Brucella. FQs easily select gyrA mutants in MEIM. The ability of mutants for infecting new macrophages remains unchanged. In this MEIM, 2nd step mutants do not emerge.

ResumenObjetivo del estudioConocer la actividad de fluoroquinolonas (FQ) y la selección de mutantes resistentes (MR) a FQ en un modelo experimental de infección en macrófagos.Material y métodosSe inocularon macrófagos de origen canino con la cepa tipo Brucella melitensis ATCC 23457 (CT) hasta alcanzar recuentos intracelulares de aproximadamente 105 UFC/mL. Los cultivos celulares fueron incubados en presencia de ciprofloxacino, levofloxacino, moxifloxacino y doxiciclina. Una vez lisadas las células, los microorganismos supervivientes fueron sembrados en placas sin antibiótico para recuento, y en medios de cultivo conteniendo antimicrobianos para selección de MR. Los MR a topoisomerasas se caracterizaron mediante PCR y secuenciación.ResultadosLos recuentos de microorganismos supervivientes tras el tratamiento con FQ y la lisis celular fueron: 14,3% ciprofloxacino, 65,3% levofloxacino y 75% moxifloxacino con respecto al control. Se seleccionaron MR a FQ en los cultivos celulares que contenían ciprofloxacino y levofloxacino, con una frecuencia en torno a 0,5 × 10−3. Todos los MR seleccionados portaban un cambio Ala87Val en gyrA, y mostraban CIM de FQ en torno a 10x la de la CT. La capacidad de estos MR para infectar nuevos macrófagos y su lisis intracelular tras tratamiento antibiótico no se modificaron de manera significativa con respecto a la CT. Usando la misma metodología, no se seleccionaron MR de segundo nivel a partir de los MR de primer nivel obtenidos.ConclusionesLa actividad intracelular de FQ frente a Brucella es baja, tanto frente a la CT como frente a mutantes con cambios en gyrA. Las FQ seleccionan con facilidad mutantes con cambios en gyrA en este modelo experimental de infección en macrófagos. La capacidad de estos mutantes para infectar nuevos macrófagos permanece intacta. En este modelo experimental de infección en macrófagos no se observó la selección de mutantes de segundo nivel.