Determinación in vitro de la actividad de los factores asociados con la virulencia de aislamientos clínicos del complejo Cryptococcus neoformans

ResumenDiferentes características fenotípicas relacionadas con la virulencia del complejo Cryptococcus neoformans han revelado su importancia en la patogenicidad. De acuerdo con estos antecedentes, se estudió fenotípicamente y genotípicamente la expresión de algunos factores de virulencia de aislamientos clínicos de las especies del complejo mencionado. Se evaluaron 35 aislamientos de C. neoformans y 19 de Cryptococcus gattii. Se estudió el crecimiento a 37 °C, la morfología macroscópica y microscópica, la frecuencia del fenómeno switching, la actividad de 23 enzimas extracelulares, la variabilidad de las colonias en medio con floxina B, la determinación del gen de la fosfolipasa B, el tipo de locus sexual mediante PCR y el patrón molecular del gen URA5 mediante RFLP. Todos los aislamientos crecieron a 37 °C. El tamaño capsular fue mayor para C. gattii (1,87 μm ± 1,47 μm) que para C. neoformans (0,83 μm ± 0,15 μm). El fenotipo switching se encontró principalmente en aislamientos de C. gattii. Todos los aislamientos expresaron la enzima ureasa y tenían una actividad media (Pz=0,54) en proteasas, pero C. gattii presentó una mayor actividad de la enzima fosfolipasa (Pz=0,43) y fenoloxidasa (Pz=0,003); el perfil enzimático con el API ZYM reveló una actividad baja en el 89% de los aislamientos para las dos especies. Se observaron diferencias morfológicas en medio con floxina B en el 13% de los aislamientos, de los cuales cinco eran C. neoformans y dos C. gattii. El gen de la fosfolipasa se amplificó en todos los casos. El 93% de los aislamientos de C. neoformans tenían el locus α y el 47,5% de C. gattii el locus a. Predominaron los patrones moleculares VNI (82,9%) y VGII (52,6%).Se observaron diferencias en la expresión in vitro de los factores de virulencia estudiados, lo cual podría verse reflejado en estudios futuros en un modelo in vivo.

SummaryDifferent phenotypic characteristics associated with virulence of the Cryptococcus neoformans species complex have shown an important role in their pathogenicity. In this study we have determined the role of phenotypically and genotypically factors of some virulence factors from clinical isolates in the two species of the complex; 35 C. neoformans and 19 Cryptococcus gattii. Growth at 37 °C, macroscopic and microscopic morphology, switching phenomenon, activity of 23 extracellular enzymes, variability of the colonies in agar with phloxin B; phospholipase B gene, and the mating type were determined by PCR; the molecular pattern was determined by URA5 RFLP. All isolates grew at 37 °C, the capsular size was greater in C. gattii (1.87 μm ± 1.47 μm) than in C. neoformans (0.83 μm ± 0.15 μm). Switching was observed mainly in isolates of C. gattii. All isolates expressed the enzyme urease, a lower activity of the proteases (Pz= 0.54), but a higher activity of the phospholipase (Pz=0.43) and phenoloxidase (Pz=0.003) was determined for C. gattii.The enzimatic profile with API ZYM showed a low activity for 89% of the isolates of both species. Variability of the strains was observed in 13% of the isolates in agar with phloxin B, five of which were C. neoformans and two C. gattii. Phospholipase B gene was amplified in all isolates; 93% of the C. neoformans had the α locus and 47.5% of C. gattii the a one. Molecular patterns VNI (82.9%) and VGII (52.6%) prevailed among the isolates studied. They were found different in vitro expressions of the virulence factors studied depending on the species, and this fact could be shown in future in vivo studies.