Preanalytic removal of human DNA eliminates false signals in general 16S rDNA PCR monitoring of bacterial pathogens in blood

PCR detection of microbial pathogens in blood from patients is a promising issue for rapid diagnosis of sepsis and early targeted therapy. However, for PCR assays detecting all bacterial groups, broad range primers, in particular the 16S rDNA targeting primers have to be used. Upcoming false signals and reduced sensitivity are a common problem as a consequence of unspecific amplification reactions with the human DNA background.Here we show that, using total DNA extracts from blood, unspecific signals occurred in general 16S rDNA PCRs as a result of the amplification of human sequences. To address this problem, we developed a protocol by which the human background DNA is removed and bacterial DNA is enriched during sample preparation, a method we termed background-free enrichment method (BFEM). In general, we aimed to exclude false signals due to the human background DNA yielded from 16S rDNA PCR, Real-Time-PCR and IGS-PCR analyses. We applied the BFEM to the analysis of blood samples from 22 patients and obtained results similar to standard blood culture methods.The BFEM allows specific and sensitive detection of pathogens in downstream PCR assays and is easy to handle due to the quick sample preparation procedure. Thus, the BFEM contributes to the generation of replicable and more reliable data in general 16S rDNA PCR assays.

RésuméLa détection PCR des agents pathogènes microbiens dans le sang des patients est un point prometteur pour le diagnostic rapide de la septicité et pour la thérapie visée tôt. Cependant, pour les essais de PCR décelant tous les groupes bactériens, de larges amorces de gamme, en particulier les 16S rADN visant des amorces doivent être utilisées. Les signaux faux et la sensibilité réduite sont un problème commun par suite des réactions non spécifiques d’amplification avec l’arrière-plan de ADN humain.Ici nous montrons que, en utilisant les extraits totaux d’ADN du sang, des signaux non spécifiques se sont produits en général 16S le rADN PCRs en raison de l’amplification des ordres humains. Pour aborder ce problème nous avons développé un protocole par lequel l’arrière-plan humain ADN est éliminé et l’ADN bactérienne est enrichie pendant la préparation de l’échantillon, une méthode que nous avons appelée la méthode fond-libre d’enrichissement (BFEM). En général, nous avons visé à exclure les signaux faux dus à l’arrière-plan humain ADN cédé de 16S PCR rADN PCR, de Real-Time-PCR et des analyses IGS-PCR. Nous avons appliqué le BFEM à l’analyse des échantillons du sang de 22 patients et nous avons obtenu des résultats semblables aux méthodes standard de culture de sang.Le BFEM permet la découverte spécifique et sensible des agents pathogènes dans les analyses descendant de PCR, il est facilement praticable en raison du procédé rapide de préparation de l’échantillon. Ainsi le BFEM contribue à la génération des analyses et des données plus fiables dans les essais généraux 16S rADN PCR.