Imagerie spectrale et analyse de séquences d’images en microscopie confocale à balayage laser

RésuméL’article développe une méthodologie de recherche basée sur l’utilisation de marqueurs fluorescents applicable aux préparations cellulaires ou tissulaires marquées, pour l’observation sur des microscopes confocaux à balayage laser.Les principes de l’imagerie spectrale qui permettent de séparer l’émission des chromophores impliqués dans un multimarquage sont décrits au préalable à la présentation de méthodes plus élaborées dont la fonction est d’améliorer la différenciation de l’émission de chacun des chromophores participant au multimarquage.Parmi ces méthodes, les méthodes d’analyse factorielle appliquées aux séquences d’images obtenues sur les microscopes permettent de séparer les chromophores ayant servi à marquer les sites sur les préparations. Les propriétés physicochimiques des chromophores servent à cette décomposition : spectres d’émission et dynamiques d’extinction.Les séquences d’images sont obtenues, soit par sélection spectrale à l’aide d’une série de filtres, soit par balayages successifs de la préparation, dans la gamme de couleur ou dans le temps.Le fluorescence resonance energy transfer (FRET) est une interaction entre deux chromophores où l’excitation est transférée d’un des chromophores dit donneur à l’autre chromophore dit accepteur lorsque notamment, la distance qui sépare les chromophores est faible. Il permet ainsi, notamment, de juger de la colocalisation de ces deux chromophores dans une préparation lorsqu’il se produit.Parmi les chromophores disponibles sur le marché, les quantum dots sont des nanocristaux qui offrent de nouvelles perspectives de marquage : taille, intensité et spécificité d’émission.

The aim of this article is to present a new methodology, which is based on the use of fluorescent markers on cellular or tissular samples to make observations on confocal microscopes.Principles of spectral imaging to differentiate emissions of fluorescent markers involved in multistainings are described prior to the presentation of more sophisticated methods, which are developed to differentiate the emissions of the markers.Among these methods, methods based on factor analysis of image sequences obtained on confocal microscopes provide the possibility to differentiate the markers involved in the staining of targets in the samples. Physical and chemical properties of markers, which are used to perform such a differentiation, are emission spectra and photobleaching velocity.Sequences of images are obtained either by spectral selection by means of filters or by a series of scans of the sample through the color spectrum or versus time.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is an interaction between two fluorescent markers where excitation is transfered from one marker (donor) to the other marker (acceptor) when mainly they are in close proximity. It gives the possibility to evaluate the colocalization of the two markers inside a sample when it occurs.Among available markers, the quantum dots are nanocrystals, which bring new opportunities for staining: size, intensity and emission specificity.