Dépistage de la maladie de Fabry par mesure de l’activité enzymatique de gouttes de sang séché sur papier filtre

RésuméIntroductionLa maladie de Fabry (MF) est une maladie génétique de transmission liée au chromosome X due à des mutations du gène GLA entrainant un déficit de l’activité α-galactosidase A. Le dépistage de la MF peut être réalisé par la mesure de l’activité de cette enzyme à partir de gouttes de sang déposées sur un papier filtre. Une amélioration de cette méthode de mesure de l’activité enzymatique est proposée afin de réduire la fréquence des faux positifs.RésultatsLa mesure de l’activité enzymatique est réalisée à partir d’un substrat synthétique non fluorescent, la 4-méthyl-ombelliferyl-α-D-galactose qui libère en milieu alcalin, si l’enzyme fonctionnelle est présente, une molécule fluorescente : la 4-méthyl-ombelliférone. La précipitation des protéines en fin d’incubation permet de stopper la réaction enzymatique, mais également d’éliminer les protéines responsables d’une inhibition aléatoire de fluorescence, pouvant entrainer des faux positifs. Un premier groupe de 209 patients a permis de proposer un seuil diagnostique de 2,1 μmol.h–1.L–1 correspondant à 40% de la valeur médiane de l’activité enzymatique des individus sains (individus sains : 5,6 ± 2,0 μmol.h–1.L–1, moyenne ± écart-type) au-dessous duquel le résultat est considéré comme positif. L’activité α-galactosidase A des hommes hémizygotes atteints de MF (n = 60) fut systématiquement inférieure à 1,1 μmol.h–1.L–1 (0,11 ± 0,2 μmol.h–1.L–1). Pour les femmes héterozygotes (n = 68), l’activité de l’α-galactosidase A était comprise entre 0 et 7,8 μmol.h–1.L–1 (2,2 ± 1,7 μmol.h–1.L–1). Un tiers des femmes environ n’est pas dépisté par ce test, en raison d’une activité enzymatique résiduelle importante. Dans ce travail, un second groupe de 33 patients a permis de valider une amélioration technique réduisant le nombre de faux positifs.ConclusionLa technique de mesure de l’activité enzymatique α-galactosidase A sur goutte de sang séché telle qu’elle a été modifiée, apparait robuste, spécifique et sensible. Elle permet de réduire le nombre de faux positifs et peut être appliquée au dépistage de populations à risque. Parallèlement, il apparaît toutefois essentiel de rappeler que les tests de dépistage enzymatique de la MF doivent être interprétés avec extrême prudence chez les femmes.

IntroductionFabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the GLA gene, which leads to a deficient activity of α-galactosidase A. α-galactosidase A activity can be assayed on dried blood spots on filter paper but the original method has been associated with a number of false positive due in great part to quenching of fluorescence. Here, we describe an adaptation of the original fluorimetric method reducing quenching of the fluorescence.ResultsA simple and sensitive fluorimetric method has been described for the determination of the α-galactosidase A activity in dried blood spots on filter paper, convenient for screening of FD in at-risk populations. The procedure uses 4-methylumbelliferyl-α-D-galactose, as a synthetic substrate for the enzyme. In this study, protein precipitation was added after incubation both to stop the enzymatic reaction and eliminate interfering proteins. With the novel method the risk of false-positive due to fluorescence quenching was minimized. A cut-off level of 2.1 μmol.h–1.L–1 (control values: 5.6 ± 2.0 μmol.h–1.L–1, mean ± SD) was chosen corresponding to 40 % of median control value. In all 60 hemizygotes males, α-gal A activities were below 1.1 μmol.h–1.L–1 (0.11 ± 0.2 μmol.h–1.L–1). In the 68 heterozygous females, α-gal A activity ranged from 0 to 7.8 μmol.h–1.L–1 (2.2 ± 1.7 μmol.h–1.L–1). Using the improved methodology, one third of the females were not identified using the enzymatic assay, due to significant residual enzyme activity.ConclusionThis improved method for the assay of α-gal A was robust and reduced the number of false-positive results. It can be applied for the screening of at-risk populations. α-galactosidase A enzymatic assay should not be used for screening for FD in women or, if used, should be interpreted cautiously together with the results of genotyping.