Utilisation du baculovirus recombinant BacVP6C pour la construction d’un contrôle positif interne du rotavirus C

RésuméBut de l’étudeSi le rotavirus du groupe A est bien étudié sur le plan épidémiologique, les autres groupes sont peu étudiés, surtout en Tunisie. Le rôle des infections à rotavirus C (RVC) chez l’homme est sous-estimé à cause de la nature sporadique de l’apparition du virus. L’objectif de notre étude a été de construire un contrôle positif interne de reverse transcription PCR (RT-PCR), afin de pouvoir mettre à la disposition des laboratoires de diagnostic un outil de dépistage des RVC.Matériel et méthodesLe contrôle positif interne (386 pb) a été construit à partir du gène 5 (1353 pb) de la souche porcine de référence Cowden, cloné dans le baculovirus recombinant BacVP6C. Un fragment de 596 pb a été amplifié par PCR de l’ADNdb de BacVP6C. Nous avons délété une partie centrale de 210 pb, puis nous avons cloné le fragment de 386 pb obtenu dans le plasmide pGEM-3Zf+ dans la région flanquée par les promoteurs de la SP6 et T7 ARN polymérase.RésultatsLe plasmide recombinant obtenu, nommé pIAM1 a été utilisé pour obtenir le contrôle positif interne par une transcription in vitro. La mise au point de la réaction de RT-PCR a été effectuée en faisant varier ses différents paramètres. La sensibilité de la détection a été déterminée, elle est de l’ordre de 3,66 × 105 molécules d’ARN par microlitre.ConclusionL’emploi d’un contrôle positif dont la taille est réduite par rapport à la souche sauvage offre une grande spécificité de la RT-PCR et permet une surveillance complète et efficace des virus entérotransmissibles responsables des gastroentérites.

AimsUnlike group A, a few studies have interested other groups of the rotavirus, especially in Tunisia. The role of rotavirus C (RVC) infection is underestimated because of its sporadic nature. The aim of our study was to develop rapid diagnostic procedures of RVC by using an internal positive control of reverse transcription PCR (RT-PCR).MethodsThe internal positive control (386 pb) was designed from the recombinant baculovirus BacVP6C containing the full length cDNA of the Cowden strain gene 5 (1353 pb). A fragment of 596 pb was amplified by PCR using the BacVP6C DNA ds as template. Then, a central part of 210 pb was deleted and the remaining fragment (386 pb) was cloned into pGEM-3Zf+ plasmid between SP6 and T7 RNA polymerase promoters.ResultsThe obtained recombinant plasmid “pIAM1” was then used for the generation of the internal positive control by in vitro transcription. The sensibility of the RT-PCR was about 3.66 × 105 molecules of RNA/μl.ConclusionThe use of a shorter positive control, as compared to the wild type, allows increased specificity of the RT-PCR reaction, and could be used for efficient diagnostic and surveillance of RVC-caused diseases.