Empreinte moléculaire des communautés bactériennes et hétérogénéité intraspécifique de l'ADNr 16S : est-il raisonnable d'occulter le problème ?

RésuméLes techniques d'empreinte moléculaire sont des méthodes indépendantes de la culture utilisées dans l'étude des communautés microbiennes. Leur utilisation pour l'identification est envisagée avec le développement de techniques rapides semi-automatisées. Le marqueur le plus utilisé, l'ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), permet d'obtenir une image assez exhaustive des communautés et d'identifier leurs membres. Cependant, le polymorphisme de l'ADNr 16S au sein d'une espèce (intraspécifique) est un écueil important, souvent négligé, de ce type d'approche.But du travailNous proposons d'évaluer la variabilité intraspécifique de l'ADNr 16S de trois espèces d'intérêt médical.Matériels et méthodesL'ADN total est extrait à partir de cultures pures d'isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa (n = 20), Clostridium difficile (n = 20) et Enterobacter cloacae (n = 14). Les produits d'amplification d'une polymerase chain reaction (PCR) consensuelle ciblée sur les régions variables V3 et V6-V7-V8 de l'ADNr 16S ont été séparés par temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE). Les bandes d'intérêt ont été séquencées et analysées.RésultatsTous les isolats testés de P. aeruginosa et de C. difficile présentent une bande unique dont la distance de migration est constante en TTGE. Aucune variabilité intraspécifique n'a donc été observée chez ces deux espèces. En revanche, les isolats d'E. cloacae présentent des profils complexes composés de bandes multiples (polymorphisme intragénomique) ayant des distances de migration différentes (polymorphisme entre souches).ConclusionCette variabilité de l'ADNr 16S au sein d'une espèce et/ou d'un génome est connue mais rend indispensable la réalisation d'un travail de description exhaustif qui seul permettra l'interprétation raisonnée des techniques d'identification par empreinte moléculaire.

Molecular fingerprinting methods are currently used to study microbial communities by culture independent approaches. They are proposed as identification tool owing to the availability of rapid automated methods. The 16S rRNA gene (16S rDNA) is an efficient marker for bacterial identification and microbial communities analysis. However, the 16S rDNA polymorphism among strains of the same species is an underestimated pitfall of the fingerprinting approaches.Aim of the studyWe studied the 16S rDNA variability among strains of three bacterial species of medical interest.Material and methodsTotal DNA was extracted from clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa (N = 20), Clostridium difficile (N = 20) and Enterobacter cloacae (N = 14). The Polymerase Chain Reaction (PCR) products obtained with consensus primers flanking the 16S rDNA variable regions V3 and V6-V7-V8 were separated by Temporal Temperature Gradient gel Electrophoresis (TTGE). DNA extracted from TTGE bands were sequenced and analysed.ResultsAll the isolates of P. aeruginosa and of C. difficile displayed one single TTGE band with constant migration distances suggesting that there was no 16S rDNA polymorphism among strains in these two species. Oppositely, the isolates of E. cloacae gave complex TTGE patterns formed by multiple bands with variable migration distances. These patterns corresponded to 16S rRNA genes variable in a single genome as well as among strains of the species.ConclusionIntra-species and/or intragenomic variability of 16S rDNA should be taken into account for pertinent interpretation of molecular fingerprint. For this purpose, a comprehensive description of the polymorphism of this marker is necessary.