Dégradation de l'ADN bactérien par de l'azote atomique produit par plasma. Apport de la détection par PCR en temps réel

RésuméObjectifsLa stérilisation bactérienne par la technologie du plasma en postdécharge montre un intérêt grandissant. L'attrait principal de ce nouveau procédé réside dans son action à sec et à basse température (60 °C). Cette technologie serait donc utile pour les appareillages médicaux complexes, sensibles à l'oxydation, à l'humidité et/ou exigeant une température inférieure à 60 °C. L'objectif de cette étude est de démontrer l'activité d'un flux d'atomes émanant d'un plasma d'azote moléculaire pur sur l'ADN bactérien : le plasma d'azote dégrade-t-il le matériel génétique ?MéthodesLes bactéries testées (Bacillus stearothermophilus, Staphylococcus aureus et Helicobacter pylori) sont cultivées sur des géloses appropriées, et l'ADN bactérien est extrait de chaque UFC par la technique des colonnes (high pure PCR template, Roche®). Chaque quantité d'ADN extraite est diluée dans 1 ml d'eau pure. Ensuite, 50 μl de chacune de ces solutions d'ADN sont disposés dans les puits de plaques Nunclon® stériles, lesquelles subissent un cycle de vide poussé pendant 60 minutes. Les résidus seront alors introduits pendant 40 minutes dans une enceinte de stérilisation par plasma (Plasmalyse®, Satelec) où le débit d'azote, la pression et la température sont respectivement réglés à 1 l/min, 5 Torr et 60 °C. L'ADN ainsi « plasmalysé », est alors récupéré par aspiration–refoulement dans 500 μl d'eau pure et traité pour subir une amplification–détection par PCR real-time (LightCycler2, Roche®). L'ADN « plasmalysé » sera comparé à l'ADN témoin1 intact, à l'ADN témoin2 ayant subi uniquement le cycle de vide, ainsi qu'à l'ADN témoin3 chauffé à 60 °C pendant 40 minutes.RésultatsLes courbes d'amplification obtenues démontrent que le vide poussé seul et la chaleur seule n'ont aucune activité sur l'ADN bactérien. En revanche, l'ADN « plasmalysé » montre une dégradation au niveau des séquences amplifiées.ConclusionL'ADN génomique bactérien, une fois extrait, est dégradé par le flux gazeux du plasma d'azote. Un procédé innovant de stérilisation du matériel médical est en cours de développement et pourra vraisemblablement s'imposer à moyen terme.

AimsBacterial sterilization by the technology of plasma in post-discharge shows a growing interest. The main appeal of this new process resides in its action at dry and low temperature (60 °C). This technology would be therefore useful for the complex medical equipment, sensitive to the oxidization, humidity and/or requiring a temperature lower than 60 °C. The objective of this survey is to demonstrate the activity of an atomic flux emanating a plasma of pure molecular nitrogen on the bacterial DNA: does the plasma of nitrogen damage the genetic material?Materials and MethodsThe bacteria tested (Bacillus stearothermophilus, Staphylococcus aureus MRSA and Helicobacter pylori) are cultivated on suitable agar, and the bacterial DNA is extracted from every CFU by the technique of the columns (High Pure PCR Template, Roche®). Every quantity of DNA extracted is diluted in 1 ml pure water. Then, 50 μl of each of these solutions of DNA are laid down in sterile Nunclon®s plates holes, which undergo an advanced emptiness cycle during 60 minutes. The DNA residues will be then introduced during 40 minutes in a plasma sterilization surrounding wall (Plasmalyse®, Satelec) where the debit of nitrogen, the pressure and the temperature are adjusted respectively to 1 L.min-1, 5 Torrs and 60 °C. The DNA so ''plasmalysé'', is recovered then by aspiration in 500 μl pure water and processed to undergo an amplification/detection by Real-Time PCR (LightCycler2.0, Roche®). The DNA ''plasmalysé'' will be compared to the intact DNA control1, to the DNA control control2 having undergone the cycle of emptiness solely, as well as to the DNA control3 solely heated to 60 °C during 40 min.ResultsThe amplification curves demonstrated that the only advanced emptiness and the only heat don't have any activity on the bacterial DNA. On the other hand, the DNA ''plasmalysé'' shows a deterioration of the amplified sequences.ConclusionThe genomic bacterial DNA, once extracted, is damaged by the gaseous flux of nitrogen plasma. A new sterilization process of the medical material will presumably impose itself in medium-term.