Thermal phase transitions in plasma membranes of cancer cells measured by means of Qdot fluorescence

Laser scattered-light applicators used for laser-induced tumor therapy (LITT) facilitate precise thermal metastases destructions. Major tissue-optical parameters (absorption coefficient μa, scattering coefficient μs, anisotropy factor g) reveal biological tissues to be strongly scattering media exhibiting a so-called “optical window” in NIR. In this spectral range therapeutic laser radiation is scattered and absorbed at deeper tissue levels leading to virtual enlargement of the laser applicator.In this study breast cancer cells MX1 were heat stressed to verify the maximum phase transition in MX1 plasma membranes. For this purpose, a novel method of quantum dots (Qdots) fluorescence dosimetry was developed. Qdot fluorescence was detected with a confocal laser scan microscope. Evaluation of measured laser-induced fluorescences yielded a first approximation of the phase transition in MX1 cells.Monolayered MX1 cells were thermally stressed at 40, 42, 45, 50 or 56 °C (30 min each). Controls were kept at 37 °C. Fluorescent cell labeling was realized via biotinylated concanavalin A (ConA) targeting glycocalix sited carbohydrate residues covering the plasma membranes. ConA then was sandwiched by red-emitting Qdots™ 605 conjugated to biotin-binding streptavidin.After exposure to low heat stress (40 or 42 °C) plasma membranes were not visibly affected. Heat stressings at 45 or 50 °C induced morphological changes of cells and tissue conformations. Also reorganization of plasma membrane structures were induced leading to more regular Qdot accumulations and higher fluorescence densities. This process coincided with shrinkage and rounding of cell shapes as a result of active stress response which was more pronounced in the 45 °C-stress group than in the 50 °C-stress group. Severe stressing at 56 °C inhibited active responses and caused destruction of membrane integrities shown by necrotic cell phenotypes associated with intracellular Qdot accumulation. Through domain formation during plasma membrane melting, the distribution of differential state transitions was relatively wide (50–56 °C).Qdot labeling of heat stressed cancer cells demonstrated alterations of plasma membrane organizations and integrities, respectively. Extents of cell lesions observed by Qdot fluorescence definitely correlated with stress doses applied during heat treatments. The phase transition temperature calculated from Qdot fluorescence images of MX1 cells was approximately 52 °C and was 20% higher than phase transition of synthetic lipid membranes.

ZusammenfassungStreulichtapplikatoren fördern bei der Laserinduzierten Tumortherapie (LITT) die präzise thermische Zerstörung von Metastasen. Die gewebeoptischen Parameter (Absorptionskoeffizient μa, Streukoeffizient μs, Anisotropiefaktor g) belegen, dass biologische Gewebe stark streuende Medien sind, die ein sogenanntes “optisches Fenster” im NIR aufweisen. In diesem Spektralbereich wird therapeutische Laserstrahlung in tieferliegenden Geweberegionen gestreut und absorbiert, was zu einer virtuellen Vergrößerung des Laserapplikators führt.In dieser Studie wurden MX1-Brustkrebszellen thermischem Stress unterworfen, um das Maximum des Phasenübergangs in MX1-Plasmamembranen zu bestimmen. Dafür wurde eine neuartige Methode der Quantendot-Fluoreszenzdosimetrie entwickelt. Die von Quantendots (Qdots) emittierte Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Laser-Scan-Mikroskop detektiert. Die Evaluierung der gemessenen laserinduzierten Fluoreszenz lieferte eine erste Annäherung an die Phasenübergänge in MX1-Zellen.Als Monolayer kultivierte MX1-Zellen wurden thermisch gestresst bei 40, 42, 45, 50 oder 56 °C (jeweils 30 min). Kontrollen wurden bei 37 °C gehalten. Die Fluoreszenzmarkierung der Zellen wurde zunächst mit biotinyliertem Concanavalin A (ConA) eingeleitet, da ConA an bestimmte Kohlehydratreste in der Glycocalix auf Plasmamembranen bindet. Die Sekundärmarkierung von biotinyliertem ConA erfolgte mit rotfluoreszierenden Qdots™ 605, die mit biotinbindendem Streptavidin konjugiert waren.Nach Einwirkung von geringem Hitzestress (40 °C oder 42 °C) waren die Plasmamembranen nicht sichtbar beeinträchtigt, während Stress bei 45 °C oder 50 °C deutliche Veränderungen der Zellmorphologien und Gewebekonformationen hervorrief. Zusätzlich wurde eine Reorganisierung der Membranstruktur beobachtet, die zu gleichmäßigeren Qdot-Anreicherungen und höheren Fluoreszenzdichten führte. Dieser Prozess ging mit Schrumpfung und Abrundung der Zellen einher als unmittelbare Folge einer aktiven Stressantwort. Diese war nach 45 °C ausgeprägter als nach 50 °C. Massiver Hitzestress bei 56 °C verhinderte aktiven Stressrespons und verursachte die Zerstörung der Membranintegritäten, was sich anhand nekrotischer Zellphänotypen und intrazellulärer Qdot-Akkumulation zeigte. Durch Domänenbildung während des Schmelzens der Plasmamembranen wurde die Verteilung der unterschiedlichen Zustandsübergänge relativ breit gestreut (50–56 °C).Mithilfe Qdot-Markierung thermisch gestresster Krebszellen ließen sich Veränderungen der Plasmamembranorganisierung und –integritäten darstellen. Die mittels Qdot-Fluoreszenz beobachteten Ausmaße der zellulären Läsionen stimmten mit den applizierten Hitzestress-Dosen überein. Die über die Qdot-Fluoreszenzbilder von MX1-Zellen ermittelte Phasenübergangstemperatur lag bei annähernd 52 °C und war demnach ca. 20% höher als der Phasenübergang synthetischer Lipidmembranen.

ResúmenLos aplicadores de luz láser dispersada usados en la terapia láser de tumores (LITT) permiten una destrucción térmica precisa de las metástasis. Los principales parámetros ópticos del tejido (coeficiente de absorción μa, coeficiente de dispersión μs, factor anisotrópico g) demuestran que los tejidos biológicos representan un fuerte medio de dispersión, exhibiendo lo que se denomina una “ventana óptica” en el Infrarrojo cercano. En esta zona del espectro, los rayos láser se dispersan y absorben en niveles más profundos del tejido, dando lugar a una ampliación virtual del aplicador láser.En este estudio, células cancerígenas de mama MX1 fueron sometidas a estrés por calor para verificar la máxima transición de fase en la membrana plasmática de estas células. Con este propósito, se desarrolló un nuevo método de dosimetría utilizando fluorescencia de puntos cuánticos (Qdots). La fluorescencia Qdot fue detectada con un microscópio confocal láser. El análisis de las medidas de fluorescencias inducidas por el láser permitió una primera aproximación de las transiciones de fase en células MX1.Monocapas de células MX1 fueron sometidas a estrés térmico a 40, 42, 45, 50 o 56 °C (durante 30 min en cada caso). Los controles fueron mantenidos a 37 °C. Las células fueron marcadas con fluorescencia mediante el uso de Concavalina A (ConA) biotinilada que reconoce residuos de carbohidratos localizados en el glicocálix que recubre las membranas plasmáticas. Para la detección secundaria de ConA se utilizaron nanocristales Qdots605 con emisión roja conjugados a streptavidina.Las membranas plasmáticas no se vieron afectadas al ser expuestas a estrés por temperaturas leves (40 °C o 42 °C). Sin embargo, temperaturas más elevadas (45 °C o 50 °C) produjeron cambios en la morfología de la célula así como en la conformación de los tejidos. A estas temperaturas incluso, se observó reorganización en la estructura de la membrana plasmática, dando lugar a acumulaciones más regulares de los Qdots y por lo tanto a una mayor densidad de fluorescencia. Este proceso coincide con la contracción y el redondeamiento de las células en respuesta al estrés, principalmente en el grupo expuesto a 45 °C más que en el de 50 °C. El estrés inducido a 56 °C inhibió las respuestas activas causando la destrucción de la integridad de la membrana, como se evidencia por la acumulación intracelular de Qdots que ocurre en células necróticas. La distribución de los diferentes estados de transición fue relativamente amplio (50–56 °C), debido a la formación de dominios durante la fluidificación de la membrana.El marcado con Qdots de células tumorales estresadas térmicamente ha demostrado cambios en la organización de la membrana plasmática y en su integridad, respectivamente. El grado de la lesión celular observada mediante fluorescencia Qdot definitivamente se correlaciona con las dosis de estrés aplicado durante los tratamientos de calor. La temperatura de transición de fase calculada a partir de las imágenes de fluorescencia Qdot de las células MX1 fue de aproximadamente 52 °C y un 20% más elevada que la transición de la fase de las membranas de lípidos sintéticos.