Digital holographic imaging of dynamic cytoskeleton changes

A variety of physical and biochemical cell properties depends on the function and integrity of the actin cytoskeleton. The actin cytoskeleton mediates crucial cellular functions as migration, intracellular transport, exocytosis, endocytosis, cell stiffness and force generation. Highly dynamic actin fibers are therefore targets for several drugs and toxins. However, the study of actin interfering processes by standard microscopy techniques fails in the detailed resolution of dynamic spatial alterations required for a deeper understanding of toxic or drug effects. Here we applied digital holographic microscopy in the online functional analysis of the actin cytoskeleton changes of a highly differentiated and a dedifferentiated pancreas tumor cell line induced by the marine toxin Latrunculin B. Scanning electron microscopy (SEM) and fluorescence microscopy showed rapid Latrunculin B induced alterations in cell morphology and actin fiber degradation in both pancreatic tumor cell lines. In contrast digital holographic in vivo analysis of the drug dependent dynamic cellular processes revealed unequal changes in cell morphology. While tumor cells with a low metastatic potential showed Latrunculin B induced cell collapse within 4 h the metastatic tumor cells were resistant to Latrunculin B treatment. Spatial resolution of morphological alterations by digital holography detected so far unknown differences in the actin cytoskeleton stability of highly differentiated and dedifferentiated pancreas tumor cell lines. These data demonstrate that marker-free, non-destructive online analysis of cellular morphology and dynamic spatial processes in living cells by digital holography offers new insights in actin dependent cellular mechanisms. Digital holographic microscopy was shown to be a versatile tool in the screening of toxic drug effects and cancer cell biology.

ZusammenfassungEine Vielzahl von physikalischen und biochemischen Zelleigenschaften wird durch das Aktin-Zytoskelett vermittelt. Darunter sind wesentliche zelluläre Funktionen wie Migration, intrazellulärer Transport, Exozytose, Endozytose, Zellsteifigkeit und Krafterzeugung. Aktinfasern sind daher Angriffspunkte für verschiedenste therapeutische Wirkstoffe und Gifte. Mit mikroskopischen Standardmethoden können dynamische Prozesse der Aktin-Reorganisation allerdings nicht mit der für das bessere Verständnis toxischer oder Medikamenten-Effekte notwendigen räumlichen Auflösung untersucht werden. Wir haben hier digitale holographische Mikroskopie zur zeitaufgelösten funktionellen Analyse der Aktin-Zytoskelett Veränderungen durch das marine Toxin Latrunculin B an hochdifferenzierten und dedifferenzierten Pankreastumor-Zelllinien eingesetzt. Rasterelektronenmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie zeigten rasche Veränderungen der Zellmorphologie und den Abbau von Aktinfasern durch Latrunculin B in beiden Pankreastumor-Zelllinien. Die in vivo Analyse der wirkstoffabhängigen dynamischen zellulären Prozesse mit Digitaler Holographie offenbarte dagegen ungleiche Änderungen der Zellmorphologie. Während die zelluläre Struktur von Tumorzellen mit einem geringen Metastasierungspotential nach 4 h Latrunculin B Einwirkung zerfiel, waren metastasierende Tumorzellen widerstandsfähig gegenüber der Latrunculin B Wirkung. Die räumliche Auflösung morphologischer Veränderungen durch digitale Holographie ermöglicht damit den Nachweis bislang unbekannter Unterschiede in der Stabilität des Aktin-Zytoskeletts von hochdifferenzierten und dedifferenzierten Pankreastumor-Zelllinien. Diese Ergebnisse zeigen, dass die marker- und zerstörungsfreie zeitaufgelöste Analyse der Zellmorphologie und dynamischer räumlicher Prozesse in lebenden Zellen mit digitaler Holographie neue Einblicke in aktinabhängigie zelluläre Vorgänge ermöglicht. Damit wird die digitale Holographie zu einem vielseitigen Werkzeug im Test toxischer Medikamenteneffekte und in der Tumorzellbiologie.

ResúmenUna variedad de características físicas y bioquímicas de la célula tales como la migración, el transporte intracelular, la exocitosis y la endocytosis, la rigidez de la célula y la generación de la fuerza dependen de la funcionalidad e integridad del citoesqueleto de actina. Las fibras altamente dinámicas de actina son por lo tanto, blancos para varias drogas y toxinas. Sin embargo, el estudio de los procesos que interfieren en la actina mediante el uso de técnicas microscópicas estándares carece de una resolución detallada de las alteraciones espaciales dinámicas requerida para una comprensión más profunda de los efectos tóxicos o de la droga. En este trabajo, aplicamos la microscopía holográfica digital para el análisis funcional online de los cambios inducidos en el citoesqueleto de actina mediante la toxina marina Latrunculin B en una línea celular de tumor de páncreas. Mientras que en el análisis por microscopía electrónica (SEM) y microscopía de fluorescencia se observaron cambios similares en ambas líneas celulares de la morfología celular y la degradación de las fibras de actina, el análisis holográfico digital in vivo de los procesos celulares dinámicos reveló cambios desiguales en la morfología celular en respuesta a Latrunculin B. Mientras que las células tumorales con bajo potencial metastático murieron dentro de las 4 h, las células metastáticas del tumor fueron resistentes al tratamiento con Latrunculin B. La resolución espacial de las alteraciones morfológicas por holografía digital detectó diferencias hasta ahora desconocidas en la estabilidad del citoesqueleto de actina en líneas célulares tumorales altamente diferenciadas y dediferenciadas del páncreas. Estos datos demuestran que el análisis no destructivo online y libre de marcador por holografía digital de la morfología celular y los procesos espaciales dinámicos en células vivas ofrece nuevas perspectivas sobre los mecanismos celulares dependientes de actina. La microscopía holográfica digital demuestra ser una herramienta versátil en la investigación de efectos tóxicos de las drogas y en la biología del cáncer.