LED fluorescence microscopy in the diagnosis of tuberculosis: Fading and restaining of smears for external quality assessment

Blinded rechecking is a method proposed for external quality assurance (EQA) of auramine-stained acid-fast bacilli (AFB) smears using fluorescence microscopy (FM), however, this procedure is not well developed and slides fading over time could compromise its implementation. Since bleaching of fluorescent molecules involves temperature-dependent chemical reactions, it is likely that low temperatures could slow down this process. We stored auramine-stained slides under different environmental conditions, including −20 °C, and examined them over time. The slides stored in all the environments faded. At −20 °C, fading was not reduced in relation to room temperature. Restaining and re-examining smears after five months showed that the slides containing saliva and storage at −20 °C were associated with failure in AFB reappearance. In conclusion, the practice of freezing slides until they are viewed should be discouraged as it has a negative effect on blinded rechecking by reducing reading concordance after restaining. Specimen quality should be considered when interpreting FM-EQA results.

ResumenLa relectura usando microscopía fluorescente con lámpara LED es una metodología propuesta para la evaluación externa de calidad (EEC) de los extendidos teñidos con auramina empleados para detectar bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR), pero el procedimiento está parcialmente desarrollado y la decoloración de los BAAR con el transcurso del tiempo puede comprometer su implementación. La decoloración de moléculas fluorescentes involucra reacciones químicas temperatura-dependientes, por lo que la reducción de la temperatura podría enlentecerla. Guardamos extendidos coloreados en distintas condiciones, incluyendo a −20 °C, y los examinamos a distintos tiempos. Las láminas guardadas en todos los ambientes se decoloraron; a −20 °C la decoloración fue más rápida que a temperatura ambiente. La recoloración evidenció que en extendidos de saliva o conservados a −20 °C existía mayor probabilidad de que los BAAR no reaparecieran. En conclusión, la conservación de extendidos en freezer debe evitarse, ya que reduciría la concordancia de lectura luego de recolorear para la EEC. La calidad de la muestra debe considerarse para interpretar la EEC.