دانلود مقالات ISI درباره واکنش زنجیره ای پلیمراز واقعی در زمان واقعی + ترجمه فارسی

در این روش که در آن از یک ماده ی فلورسنت و یک Detector استفاده می شود در هر سیکل، ماده ی فلورسنت که معمولاً رنگ SYBR می باشد به طور غیر اختصاصی به محصولات دو رشته ای تولید شده در هر سیکل متصل شده و در طول موج خاصی، مازاد طول موجی را که با آن تحریک شده است را به صورت نور فلورسنت از خود نشر می کند که این نور نشر شده توسط آشکارکننده (Detector) دستگاه قابل اندازه گیری خواهد بود. از طرفی از آنجا که در طی واکنش، لوله های واکنش باز نمی شوند، احتمال آلودگی در لوله ها بسیار پایین است. در حال حاضر ابزار متعددی برای انجام دادن واکنش های Real time PCR در دسترس هستند که اکثر آنها بر پایه ی پدیده ی انتقال انرژی رزونانسی (FRET) استوار هستند. موارد استفاده از Real-time PCR از آنجا که این روش یک روش شناسایی کننده است، از این روش می توان در شناسایی و تعیین مقدار پاتوژن ها (عوامل مهاجم نظیر ویروس ها) در نمونه، میزان mRNA بیان شده و با بهره گیری از شناسایی کمی روش نیز می توان تعداد دقیق نسخه های موجود از نمونه ی هدف (برای مثال mRNA) را شناسایی کرد. در این روش می توان به بررسی بیان ژن از دو طریق کاملاً متفاوت پرداخت: در روش کمی مطلق ( Quantification Absolute) با استفاده از یک منحنی استاندارد می توان تعداد دقیق نسخه های یک mRNA را بررسی کرد. در روش کمیتی نسبی (Relative quantification) میزان بیان ژن در مقایسه با یک ژن دیگر که معمولاً یک ژن خانه دار (House-Keeping) می باشد اعلام می شود. ژن خانه دار معمولاً ژنی است که در تمام رده های سلولی به میزان یکسانی بیان می شود و میزان بیان آن ارتباطی با میزان بیان ژن مورد بررسی ندارد. GAPDH، واکنش زنجیری پلیمراز در زمان واقعی و و HPRT از نمونه های معروف این دسته از ژن ها هستند. فازهای مختلف یک واکنش real time PCR فاز اول که در آن گرچه همانند سازی به شکل تصاعدی انجام می شود، ولی به دلیل اینکه نور فلورسانتی که از نمونه ها نشر می شود کمتر از آستانه ی تشخیص Detector دستگاه می باشد در محاسبات دستگاه استفاده نمی شود و دستگاه آن را به عنوان خطا (noise) در نظر می گیرد. مرحله ی دوم مرحله ای است که میزان نور فلورسنت نشر شده به آستانه ی تشخیص دستگاه رسیده و برای دستگاه قابل تشخیص می شود. مرحله ی سوم فازی است که سرعت همانند سازی نمونه ها به دلیل تحلیل رفتن مواد واکنش و شرایط آن کم می شود. منحنی تکثیر یک واکنش Real time PCR در تصویر زیر نشان داده شده است. روش‌های سنجش با Real-time PCR به طور کلی دو روش برای انجام این آزمایش وجود دارد: روش غیر اختصاصی: که در آن از رنگ های فلورسنت مثل SYBR استفاده می شود که توانایی اتصال به اسید نوکلئیک دو رشته را به صورت غیر اختصاصی دارد. روش اختصاصی: که در آن ها از Probe ها استفاده می شود و یکی از معمول ترین روش های آن Taq-man probe است. روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR همان طور که گفته شده در آن از رنگ های فلورسانتی مثل SYBR استفاده می شود که توانایی اتصال به DNA را به طور غیر اختصاصی دارند. این روش، روشی ارزان و آسان است، ولی یکی از معایب بزرگ آن اتصال غیر اختصاصی رنگ به محصولات دو رشته است به این معنی که رنگ متفاوتی بین دو رشته های پرایمر- دیمر و محصول هدف قائل نمی شود که این ممکن است در گزارش نتایج توسط دستگاه تداخل ایجاد کند. به این منظور باید شرایطی برای واکنش در نظر گرفته شود که حداقلِ شرایط برای تولید دیمر های پرایمری محیا باشد. در این روش برای تغییر نتایج از آنالیز منحنی ذوب (Melt curve Analysis) استفاده می شود.