Confocal Raman microscopy as a diagnostic tool for investigation of living neuroblastoma tumour cells

The investigation of living cells at physiological conditions requires very sensitive, sophisticated and non-invasive methods. In this study, Raman spectroscopy, a chemically and structurally sensitive measuring technique is combined with high-resolution confocal microscopy to investigate different biomolecules inside of cells. In Raman spectral imaging mode, a complete Raman spectrum is recorded at every confocal image point, giving insight into the chemical composition of each sample compartment.Neuroblastoma is the most common solid extra-cranial tumour in children. One of the unique features of neuroblastoma cells is their ability to differentiate spontaneously, eventually leading to complete remission. Since differentiation agents are currently used in the clinic for neuroblastoma therapy, there is a special need to develop non-invasive and sensitive new methods to monitor the level of differentiation in neuroblastoma cells.Differentiation of neuroblastoma cells was induced by treatment with retinoic acid and cells at different degrees of differentiation were analysed with the confocal Raman microscope alpha300 R (WITec GmbH, Germany), using a frequency doubled Nd:YAG laser at 532 nm and 10 mW for excitation. Integration time per spectrum was 80–100 ms. A lateral resolution in submicrometer range was achieved by using a 60× water immersion lens with a numerical aperture of 1.0. Raman images of cells were generated from these sets of data by either integrating over specific Raman bands or by cluster analysis. The automated evaluation of all spectra results in spectral unmixed images, which provide insight into the chemical composition of the sample. With these procedures, different cell organelles, cytosol, membranes could be distinguished. Since neuroblastoma cells at high degree of differentiation overproduce noradrenaline, an attempt was made to trace the presence of this neurotransmitter as a marker for the differentiation process. The results of this work may have applications in the monitoring of molecular changes and distribution of biomolecules as they occur during the differentiation of neuroblastoma cells.

ZusammenfassungZur Untersuchung von lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen sind sehr empfindliche und nicht invasive Methoden erforderlich. Aus diesem Grund wurde die konfokale Raman Mikroskopie angewendet, um die Verteilung von Biomolekülen innerhalb lebender Neuroblastom Zellen aufzuklären. Bei der sogenannten „Raman spectral imaging” Methode wird ein komplettes Raman Spektrum von jedem Pixel aufgenommen und damit die chemische Zusammensetzung analysiert.Beim Neuroblastom handelt es sich um den häufigsten extrakranialen soliden Tumor im Kindesalter. Neuroblastom Zellen haben die einzigartige Eigenschaft, spontan zu differenzieren, wobei dieser Prozess zu einer vollständigen Remission führen kann. Eine Behandlungsmethode beruht daher auf der gezielten Differenzierung von Neuroblastomen. Nicht invasive, empfindliche Methoden sind jedoch notwendig, um diesen Differenzierungsprozess zu verfolgen.Im Rahmen dieser Arbeit wurden Neuroblastom Zellen mit Retinsäure differenziert und Zellen unterschiedlichen Differenzierungsgrades mit dem konfokalen Raman Mikroskop untersucht. Zur Anregung wurde ein frequenzverdoppelter Nd:YAG Laser bei 532 nm verwendet, mit einer Leistung von 10 mW. Die Integrationszeit für die Aufnahme eines Spektrums betrug 80–100 ms. Bei Verwendung eines Wasserimmersions-Objektivs mit 60-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,0 wurde eine laterale Auflösung im Submikrometerbereich erreicht. Raman Bilder von Zellen wurden entweder durch Integration über bestimmte Raman Banden oder durch die sogenannte Cluster Analyse generiert. Mit diesen Methoden konnten verschiedene Zellbestandteile, wie Organellen, das Zytosol oder die Zellmembran dargestellt werden. Es wurde insbesondere untersucht, ob sich Noradrenalin als Marker der Differenzierung nachweisen lässt.Zusammenfassend kann man sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen könnten, die molekularen Änderungen und die Verteilung der Biomoleküle während der Differenzierung von Neuroblastom Zellen zu verfolgen.

ResúmenLa investigación de células vivas en condiciones fisiológicas requiere métodos no invasivos, muy sensibles y sofisticados. En este estudio, la espectroscopía Raman altamente sensible para la medición química y estructural, ha sido combinada con la Microscopía Confocal de Alta Resolución para la investigación de diversas biomoléculas dentro de la célula. Mediante el método conocido como “Raman spectral imaging” es posible registrar un espectro completo Raman en cada punto confocal de la imagen, obteniendo así una idea de la composición química de cada compartimiento de la muestra.El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más frecuente en la infancia. Una de las características particulares de las células de neuroblastoma es su capacidad para diferenciarse espontáneamente, lo cual puede incluso conducir a su remisión completa. Dado el uso actual de agentes de diferenciación en el tratamiento clínico del neuroblastoma, el desarrollo de nuevos métodos no invasivos y sensibles para el monitoreo del nivel de diferenciación de las células resulta indispensable.En este estudio, la diferenciación de células de neuroblastoma fue inducida mediante el tratamiento con ácido retinoico y los diversos grados de diferenciación fueron analizados con un microscopio confocal Raman alpha300 R (WITec gmbH, Alemania) con un láser Nd:YAG de doble frecuencia de 532 nm y una excitación de 10 mW. El tiempo de integración por espectro fue de 80–100 ms. Se alcanzó una resolución lateral dentro de un rango submicrométrico mediante el uso de una lente de inmersión de agua de 60× con una abertura numérica de 1.0. Las imágenes Raman de las células fueron generadas a partir de los datos obtenidos mediante su integración en bandas Raman específicas o bien a través del análisis en “cluster”. La evaluación automatizada de todos los espectros resulta en imágenes espectrales que proporcionan un mejor conocimiento de la composición química de la muestra. Con este procedimiento, es posible entonces diferenciar tanto diversas organelas como el citoplasma y las membranas. Dado que las células altamente diferenciadas de neuroblastoma producen niveles elevadamente altos de noradrenalina, se intentó utilizar este neurotransmisor como marcador del proceso de diferenciación. De este modo, los resultados de este trabajo podrían ser aplicados para el seguimiento de los cambios moleculares y la distribución de biomoléculas durante la diferenciación de las células de neuroblastoma.