El neuron-derived orphan receptor-1 previene la apoptosis inducida por la hipoxia en las células endoteliales vasculares

ResumenAntecedentesEl neuron-derived orphan receptor-1 (NOR-1) es un receptor nuclear que está sobreexpresado en las lesiones ateroscleróticas humanas y que participa en la proliferación de las células endoteliales (CE) en respuesta al factor de crecimiento del endotelial vascular (VEGF) y a otros mitógenos. Nuestro objetivo fue analizar la regulación del NOR-1 por la hipoxia en las CE.ResultadosLa hipoxia indujo la expresión del NOR-1 de forma dosis y tiempo dependiente. El BAPTA-AM (un quelante de calcio) previno la inducción del NOR-1 por la hipoxia, pero no así los inhibidores de la p38 MAPK, de la MEK1/2 o de la proteína quinasa C. Ni los anticuerpos contra el VEGF ni SU5614 (un inhibidor del receptor-2 del VEGF) afectaron a la inducción del NOR-1 por la hipoxia. La hipoxia no activó la proteína de unión al elemento de respuesta a adenosín monofosfato-3', 5' cíclico, CAMP un factor de transcripción que participa en la inducción del NOR-1 por el VEGF. Por el contrario, al reducir los niveles de proteína del factor inducido por hipoxia HIF-1α con inhibidores de la vía PI3K/Akt/mTOR o mediante siRNA contra HIF-1α, se previno el aumento de los niveles del RNA mensajero del NOR-1 en respuesta a la hipoxia. En los ensayos de transfección transitoria, la actividad del promotor del NOR-1 fue incrementada por la hipoxia o por la cotransfección con un plásmido de expresión del HIF-1α. Identificamos un elemento de respuesta a la hipoxia en el promotor del NOR-1 responsable de su regulación por la hipoxia, como demostramos mediante análisis de deleciones seriadas y de construcciones mutagenizadas. Por último, la sobreexpresión del NOR-1 (con un plásmido recombinante bicistrónico) disminuyó la proporción de células apoptóticas (anexina V positivas/yoduro de propidio negativas), mientras que la inhibición del NOR-1 (utilizando siRNA específicos) incrementó la tasa de apoptosis celular.ConclusionesPor tanto, el factor inducido por hipoxia-1 modula la expresión del NOR-1, un factor de transcripción que regula la respuesta de supervivencia de las CE a la hipoxia.

BackgroundNOR-1 is a nuclear receptor that is overexpressed in human atherosclerotic plaques. This receptor is involved in endothelial cell (EC) growth induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) and other mitogens. Our aim was to analyze NOR-1 regulation by hypoxia in EC.ResultsHypoxia increased NOR-1 mRNA levels in a time- and dose-dependent manner. Hypoxia-induced NOR-1 expression was prevented by BAPTA-AM (a calcium chelator) but not by inhibitors of p38 MAPK, MEK1/2 or protein kinase C (PKC) pathways. Incubation of EC with blocking antibodies against VEGF or SU5614 (a VEGF-R2 inhibitor) did not prevent hypoxia-induced NOR-1 expression. Hypoxia did not significantly induce early activation of cAMP response element binding protein (CREB), a key transcription factor involved in the up-regulation of NOR-1 expression by VEGF. In contrast, reduction of hypoxia-induced HIF-1α protein levels by inhibitors of the PI3K/Akt/mTOR pathway or by siRNA against HIF-1, significantly counteracted hypoxia-induced NOR-1 up-regulation. In transient transfection assays, the activity of the NOR-1 promoter construct was increased by hypoxia or by co-transfection with an HIF-1α expression plasmid. We identified a hypoxia response element in the NOR-1 promoter responsible for this hypoxia-mediated effect as shown by site-directed mutagenesis and serial deletions. Finally, over-expression of NOR-1 (using a bicistronic recombinant plasmid) decreased the rate of cells undergoing apoptosis (annexin V positive/propidium iodide negative), while inhibition of NOR-1 (using specific siRNA) increased cell apoptosis.ConclusionsTherefore, HIF-1 modulates the expression of NOR-1, a transcription factor that regulates the survival response of EC to hypoxia.