دانلود مقالات ISI درباره واکنش زنجیره ای رونویسی-پلیمراز معکوس + ترجمه فارسی

RT-PCR روشی اختصاصی، دقیق و کارآمد برای آشکار سازی (detection) رونوشت های (transcripts ) کمیاب و بررسی نمونه هایی با مقدار محدود، به حساب می آید. به واسطه نقش کلاسیک مرحله RT در سنتز DNA ی مکمل یا همان (complementary DNA) تک رشته ای، این روش از روش های بررسی بیان ژن را به طور کلی RT-PCR می نامند. در مرحله اول روش RT- PCR از ملکول RNA ( رونوشت ژنی ) به عنوان الگو برای سنتز مولکول cDNA استفاده می شود، بدین منظور یک آنزیم نسخه بردار معکوس( Reverse Transcriptase ) ویروسی به همراه یک روش مناسب برای شروع واکنش پلی مریزاسیون مورد نیاز است. سپس در مرحله بعد با کمک PCR مولکول cDNA به طور لگاریتمی افزایش می یابد. محصول PCR استفاده های گوناگونی می تواند داشته باشد. روش کار Real Time PCR: در این روش از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR به کار می رود. فلوروسنت از مولکول گزارشگر ساتع می شود که تولیدات را چند برابر می کند. بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده می شود این تکنیک به دو روش تقسیم بندی می شود: 1-تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ های باند شده بهDNA: در اینجا از رنگ های باند شده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش PCRاستفاده می شود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساتع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBR® Green به همراه DNA دو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNA باند می شود. در داخل محلول، رنگ هایی که باند نشده اند فلوروسنت خیلی کمی را نشان می دهند و فلوروسنت زمانی به وضوح افزایش می بابد که رنگ به DNA دو رشته ای پیوسته شود. SYBR® Green تحت شرایط PCR پایدار وبا ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده می شود. 2-تشخیص اختصاصی با استفاده از شناساگرهای هدف: در این روش از تعدادی شناساگرهای الیگونوکلئوتیدی استفاده میشود که از رنگ فلوروسنت گزارشگر به همراه رنگ خاموش کننده) (Quencher استفاده می شود. شناساگرهای مورد استفاده در اینجا شامل Molecular Beacons، TaqMan Probes، FRET Hybridization Probes و Scorpion Primers می باشد. کاربردهایReal Time PCR: تحقیقات میزان بیان mRNA. 2- اندازه گیری میزان همانند سازی DNA در ژنوم یا DNAهای ویروسی. 3- میزان تأثیر دارو درمانی. 4- سنجش آسیب های. DNA 5- تشخیص عوامل بیماری زا. 6- تعیین ژنوتیپ افراد. 7-سنجش تفکیک شدن آلی. نتیجه گیری: نتایجReal time PCR سریع و دقیق بدست می اید در این روش از مرحله نمایی واکنش برای تشخیص استفاده می شود که مزیت هایی را نسبت به مرحله پلاتئو که در روش معمولی استفاده می شود دارد. محدوده دینامیکی تشخیص افزایش می یابد و نیز نیازی به سرعت و عجله در انجام پروسه PCR نمی باشد. این تکنیک قدرت تفکیک پذیری بالای دارد به طوری که قادر به تشخیص تغییرات کمتر از دو فولد نیز می باشد. در حالی تفکیک پذیری ژل آگارز بسیار ضعیف می باشد. این روش برای ارزیابی مقادیر دقیقی از DNA و RNA استفاده می شود در ضمن دشواری های روش معمولی را ندارد.